طراحی روش تعیین غلظت dna انسانی به کمک تکنیک real-time pcr

(polymerase chain reaction (pcr) یک تکنیک پرکاربرد مولکولی است. با استفاده از تکنیک pcr می توان مولکول dna را به مقدار زیاد تکثیر نمود. pcr سنتز ویژه و نمایی یک ناحیه dna از پیش تعیین شده،است. واکنش های تکثیر pcr عموما بسیار ویژه اند، ویژگی با اتصال درست توالی ویژ? پرایمرها یا توالی های مکمل آنها در مولکول dna هدف تکثیر شونده تعیین می شود. روش های مختلفی جهت اندازه گیری غلظت dna وجود دارد که از جمله آنها می توان به روش های اسپکتوفتومتری، الکتروفورز و pcr، اشاره کرد. اندازه گیری بر پایه pcr، دو نوع است: 1- مشاهده نقطه پایانی 2- quantitative pcr. در روش quantitative pcr، تکثیر در فاز لگاریتمی از طریق مانیتور متصل به دستگاه در هر لحظه قابل مشاهده است. حساسیت این روش نسبت به سایر روش ها بالاتر است. در مجموع این روش، بهترین روش برای محاسبه غلظت dna است. طی این پروژه، یک روش برای محاسبه غلظت های مجهول dna موجود در خون انسان با استفاده از تکنیک quantitative pcr و شناساگر رنگی سایبرگرین ارائه شده است. برای این منظور شرایط تکثیر dna از جمیع جهات optimize شد. در ادامه با استفاده از غلظت نمونه های مرجع و تهیه سری رقت، منحنی تکثیر استاندارد رسم گردید. با استفاده از این منحنی غلظت نمونه های ناشناخته محاسبه شد. منحنی تکثیر استاندارد براساس لگاریتم غلظت نمونه های معلوم و مقدار ct، رسم می شود. اولین سیگنالی که دستگاه در اثر تکثیر dna از خود ساطع می کند، ct است.در این واکنش تکثیر در فاز نمایی صورت می گیرد و باید شیب منحنی در این منطقه را در نظر گرفت. شیب منحنی استاندارد بازده واکنش را نشان می دهد. در بهترین حالت و بازده نزدیک به 100%، مقدار آن 3.32- می باشد. با استفاده از اطلاعات بدست آمده برای منحنی استاندارد، معادله خط این منحنی رسم شد. همچنین مقدار ct، برای نمونه های مجهول نیز حین فرایند تکثیر بدست آمد. با استفاده از ct بدست آمده برای نمونه های مجهول و قرار دادن آن در معادله منحنی استاندارد، غلظت نمونه های مجهول محاسبه شد.